알칼리 용해에 의한 플라스미드 추출 방법은 다음과 같다.
1. 실험 원리:
알칼리 용해에 의해 추출된 플라스미드는 ** * 원자가 폐쇄 원형 플라스미드 DNA와 선형 염색체 DNA 사이의 위상학적 차이로 인해 분리됩니다. 12.0과 12.5 사이의 좁은 범위의 pH 값에서는 선형 DNA 이중 나선 구조가 풀리고 변성됩니다. 이러한 조건에서는 원자가가 높은 폐쇄 루프 플라스미드 DNA의 수소 결합이 끊어지지만 두 개의 상보 가닥이 코일을 형성합니다. 서로를 감싸고 단단히 묶여 있습니다.
pH 4.8 아세트산 칼륨 고염 완충액을 첨가하여 pH를 중성으로 복원하면 원자가가 높은 폐쇄 원형 플라스미드 DNA의 상보적인 두 가닥이 함께 남아 있어 재생이 빠르고 정확하지만, 선형 염색체 DNA의 두 상보 가닥은 서로 완전히 분리되어 있어 재생이 그렇게 빠르고 정확하지 않습니다. 원심분리를 통해 염색체 DNA와 불안정한 거대분자 RNA, 단백질-SDS 복합체 등이 얽혀 있습니다. . 함께 침전되어 제거됩니다.
2. 작업 단계:
1. 멸균된 배양 튜브 20ml를 준비하고 번호를 매긴 다음 LB 배양 배지 8ml를 추가한 다음 해당 항생제를 8μl씩 추가할 수 있습니다. ;
2. 10μl 흰색 피펫 팁을 사용하여 단일 콜로니를 배양 튜브에 넣고 밤새 37°C에서 흔들어줍니다.
3. 하룻밤 배양액 2ml를 원심분리관에 넣고 10,000rpm으로 실온에서 2분간 원심분리한 후 상층액을 제거합니다. (세균액이 원심분리될 때까지 2단계를 반복합니다.) (종이를 이용하여 상층액을 흡수시킵니다. )
4. 세균 세포가 침전된 원심분리관에 완충액 P1(RNase A 함유) 250μl를 넣고 피펫으로 잘 섞은 후 세균 세포를 현탁시킵니다.
5. 완충액 P2에 250μl를 추가하고 4~6회 위아래로 천천히 혼합하여 투명한 용해물을 얻습니다. (격렬하게 혼합하면 염색체 DNA가 절단되고 플라스미드의 순도가 감소합니다.) p>
6. 350?l Buffer N3를 넣고 즉시 4~6회 위아래로 천천히 섞어줍니다. 이때 흰색 응집 침전물이 나타납니다. 실온에서 15분간 10,000rpm으로 원심분리합니다.
7. 6단계에서 얻은 상청액을 깨끗한 흡수 컬럼으로 조심스럽게 옮깁니다. 펠렛이나 세포 파편이 흡입되지 않았는지 확인하십시오. 용해물이 흡수 컬럼을 완전히 통과할 때까지 실온에서 10,000 rpm으로 1분간 원심분리한 후 수집 튜브의 폐액을 폐기합니다.
8 흡착 컬럼에 Buffer PB 150μl를 추가합니다. 10,000rpm에서 1분간 원심분리하고 수집 튜브를 폐기합니다.
9. 흡착 컬럼에 400μl의 완충액 PW를 추가하고(무수 에탄올 첨가 여부 확인), 1분간 10,000rpm으로 원심분리합니다. , 수집 튜브에 폐액을 붓습니다. 다시 2분 동안 비우고(이때 Buffer EB를 65~70℃로 가열할 수 있음);
10. 흡착 컬럼을 새 원심분리 튜브에 넣고 뚜껑을 열고 약 4분간 공기를 불어넣습니다. 분 (에탄올이 제거되었는지 확인하십시오. 에탄올은 다음 단계에 영향을 미칩니다.)
11. 흡착 컬럼의 흡착막 중간 부분에 90μl Buffer EB를 추가합니다(pET의 사본 수). 시리즈가 낮을 경우 70μl EB만 추가하고 실온에 2분간 방치하세요. 10,000rpm으로 1분 동안 원심분리합니다.
12. 액체를 다시 흡착 컬럼에 붓고 1분 동안 10,000rpm으로 원심분리합니다.
13. , 표시를 하고 뚜껑을 열고 실온에 2시간 정도 방치합니다. 플라스미드를 -40°C에 보관하세요.