알칼리 용해에 의한 플라스미드 추출의 기본 원리와 주요 시약의 기능은 다음과 같습니다.
세균 현탁액을 pH 값이 높은 강한 음이온성 세제에 노출시키면 세포벽이 파열되면 염색체 DNA와 단백질이 변성되어 플라스미드 DNA가 상청액으로 방출됩니다.
알칼리성 용매는 염기쌍 결합을 완전히 파괴하지만, 닫힌 원형 플라스미드 DNA 이중 가닥은 위상적으로 서로 얽혀 있기 때문에 서로 분리되지 않습니다. 알칼리 처리의 강도와 기간이 과도하지 않는 한, pH가 중성으로 돌아오면 DNA 이중 가닥이 다시 형성됩니다.
용해 과정에서 박테리아의 단백질, 파열된 세포벽, 변성된 염색체 DNA가 서로 얽혀 큰 복합체를 이루고 라우릴 황산염으로 코팅됩니다. Na 대신 K를 사용하면 복합체가 원심분리에 의해 제거된 후 상청액에서 재생된 플라스미드 DNA를 회수할 수 있습니다.
SDS가 있는 알칼리성 가수분해는 모든 대장균 균주에 적용할 수 있으며 1mL에서 500mL 이상의 박테리아 배양량을 가질 수 있는 매우 유연한 기술입니다.
자세한 내용은 다음과 같습니다.
pH 12.0~12.6의 알칼리성 환경에서는 박테리아의 선형 고분자량 염색체 DNA가 변성되어 분리되는 반면, 원자가가 높은 폐쇄형 DNA는 원형 플라스미드 DNA는 변성되었지만 여전히 위상학적으로 얽혀 있습니다.
pH를 중성으로 조정하고 염도가 높고 온도가 낮은 경우 대부분의 염색체 DNA, 고분자량 RNA 및 단백질은 세제 SDS의 작용으로 침전되는 반면 플라스미드는 DNA는 가용성 상태로 남아 있습니다.
원심분리를 통해 대부분의 세포 잔해, 염색체 DNA, RNA 및 단백질을 제거할 수 있습니다. 플라스미드 DNA는 여전히 상청액에 남아 있습니다. 그런 다음 플라스미드 DNA를 페놀과 클로로포름으로 추출하여 플라스미드를 추가로 정제합니다. DNA.
알칼리 용해는 플라스미드 DNA를 추출하는 데 일반적으로 사용되는 방법으로, 기본 원리는 알칼리 조건(pH12.5)에서 선형 염색체 DNA 이중 나선 구조입니다. 플라스미드 DNA의 수소 결합이 끊어지더라도 두 개의 상보적인 가닥은 서로 얽혀 단단히 결합되어 있습니다.