유비퀴틴-프로테아좀에 의한 단백질 분해 연구를 위한 기본 아이디어(그림과 텍스트로 자세한 설명)

유비퀴틴은 76개의 아미노산을 함유하고 크기가 약 8.6kDa인 작은 단백질로 진핵생물에 널리 분포되어 있습니다. 인간 게놈의 4개 유전자는 유비퀴틴을 암호화합니다: UBB, UBC, UBA52 및 RPS27A.

유비퀴틴에는 7개의 라이신 잔기(K6, K11, K27, K29, K33, K48, K63)와 1개의 메티오닌 잔기(M1)가 있습니다. 유비퀴틴 사이의 다양한 연결은 주로 라이신 잔기와 메티오닌 잔기를 통해 이루어집니다. 생성된 유비퀴틴 사슬은 단백질 기질을 수정하고 그 기능을 결정하는 특정 토폴로지를 생성합니다.

기질 단백질에 유비퀴틴을 첨가하는 것을 단백질의 유비퀴틴화라고 합니다. 단백질 유비퀴틴화는 진핵생물 생물학의 거의 모든 측면에 관여하는 역동적이고 다면적인 번역 후 변형입니다. 유비퀴틴화에는 유비퀴틴 활성화 효소(E1), 유비퀴틴 결합 효소(E2s) 및 유비퀴틴 리가제(E3s)에 의해 각각 수행되는 활성화, 접합 및 결찰의 세 가지 주요 단계가 포함됩니다. 그 중에는 UBA1과 UBA6의 두 가지 종류가 있으며, 인간 E2에는 수백 가지 종류가 있습니다.

E3 효소에는 HECT 도메인과 RING 도메인이라는 두 가지 도메인 중 하나가 있습니다. HECT 도메인의 E3 리가아제는 먼저 유비퀴틴 자체에 결합한 다음 유비퀴틴을 기질로 전달하는 반면, RING 도메인의 E3 리가아제는 E2 효소가 유비퀴틴을 기질에 직접 전달할 수 있도록 합니다.

HECT 도메인 E3는 2가지 메커니즘을 통해 유비퀴틴 표적 기질을 연결합니다. 먼저 유비퀴틴이 E2의 활성 부위에서 E3의 활성 부위에 있는 Cys로 전달된 다음 표적 기질의 Lys 잔기가 유비퀴틴화됩니다. 대조적으로, RING 및 RING 관련 도메인 E3 리가제는 단일 단계로 표적 기질의 유비퀴틴화를 위한 스캐폴드 역할을 합니다. E2는 유비퀴틴을 표적 기질의 Lys 잔기로 직접 전달합니다.

현재 인체에는 E4 효소가 여전히 존재하고 있습니다. E4 효소는 모노유비퀴틴화된 기질의 유비퀴틴 사슬을 연장하여 폴리유비퀴틴화를 형성할 수 있는 유비퀴틴 사슬 연장 인자입니다.

모노유비퀴틴화는 기질 단백질 잔기에 유비퀴틴 분자를 첨가하는 것입니다. 폴리모노유비퀴틴화는 하나의 유비퀴틴 분자를 여러 기질 잔기에 첨가하는 것입니다. 폴리유비퀴틴화는 기질 단백질의 단일 잔기에 유비퀴틴 사슬이 형성되는 것입니다. 현재 유비퀴틴이 결합할 수 있는 기질 잔기에는 라이신, 세린, 시스테인 및 티로신이 포함됩니다.

유비퀴틴과 기질 사이의 연결 부위에 따라 현재 유비퀴틴이 결합하는 방식은 M1을 포함해 9가지가 있습니다. , K6, K11, K27, K29, K33, K48, K63, G76. 유비퀴틴화의 다양한 모드는 다양한 기능을 조절합니다. 그 중 프로테아좀 분해와 관련된 유비퀴틴화는 K48이다.

포괄적인 단백질체학 연구를 통해 수만 개의 단백질에서 수천 개의 유비퀴틴화 부위가 확인되었습니다. 대부분의 단백질은 세포 수명 중 어느 시점에서 유비퀴틴화를 겪습니다.

단백질 유비퀴틴-프로테아좀 분해를 연구하는 것은 주로 두 단백질, 즉 E3 리가제와 기질 단백질 사이의 관계를 연구하는 것입니다.

시클로헥시미드(CHX)는 세포내 단백질 합성을 억제하는 물질입니다. MG132는 프로테아좀 억제제입니다.

그림 3에서 각 시점에서 큰 변화가 없었던 MG132 무처리군의 SUBSTRATE 단백질과 비교하면, MG132 처리군의 SUBSTRATE 단백질 수준은 2h, 4h, 8시간 이는 SUBSTRATE의 분해가 프로테아좀과 관련이 있음을 보여줍니다.

도 4에서 E3 ubiquitin ligase의 발현량이 증가함에 따라 기질단백질의 발현량이 감소하는 것을 확인할 수 있다. 도 5에서, E3 유비퀴틴 리가제 불활성화 돌연변이의 발현 수준이 증가함에 따라 기질 단백질의 발현 수준은 크게 변하지 않음을 알 수 있다. 그림 6에서는 E3 ubiquitin ligase의 siRNA를 사용하여 세포 내 E3 ubiquitin ligase의 발현 수준을 knock down하였고, 이에 따라 기질 단백질의 발현 수준이 증가하였습니다. 그림 7에서 E3 유비퀴틴 리가제 효소의 과발현은 기질 단백질의 반감기를 감소시킵니다. 그림 8에서 E3 유비퀴틴 리가제 효소를 녹다운하면 기질 단백질의 반감기가 증가했습니다. 이는 E3 유비퀴틴 리가제가 기질 단백질의 발현 수준을 감소시킬 수 있음을 보여줍니다.

면역침전법을 사용하여 두 단백질 사이의 상호 작용을 감지합니다. 이는 대략 다음 세 가지 유형으로 나뉩니다.

문헌이나 생물정보학을 통해 E3 유비퀴틴 리가제 및 기질 단백질의 다양한 도메인을 분석합니다. 도 15의 상단 부분은 E3 유비퀴틴 리가제의 서로 다른 도메인인 도메인1, 도메인2, 도메인3 및 도메인4의 개략도이고, 도 15의 하단 부분은 기질 단백질의 서로 다른 도메인인 도메인A, 도메인B의 개략도이다. , 도메인C, 도메인D. 면역침전 방법을 사용하여 두 단백질의 서로 다른 도메인 간의 상호 작용을 감지합니다(그림 16 및 그림 17 참조). 해당 도메인을 찾은 후 두 도메인 간의 상호 작용을 감지합니다(그림 18 및 그림 19 참조).

일반적으로 단백질 유비퀴틴화를 검출하기 위해 외인성 발현 유비퀴틴 분자가 사용되며, 내인성 유비퀴틴 항체도 사용될 수 있습니다. 유비퀴틴화는 유비퀴틴 분자가 기질 단백질에 결합하는 것이기 때문에 SDS는 이 상호 작용을 파괴할 수 없으므로 그림 20에서 폴리유비퀴틴화 사슬의 존재를 볼 수 있습니다. 하나의 유비퀴틴 분자는 약 8.5KD이므로 IB 결과는 기질 단백질을 기준으로 명확한 래더 밴드 또는 스미어 밴드로 나타날 수 있습니다.

단백질 유비퀴틴화는 단백질 기능을 조절할 수 있는 단백질의 번역 후 변형입니다.

현재 유비퀴틴화 유형에는 K6, K11, K27, K29, K33, K48 및 K63이 포함됩니다. 즉, 유비퀴틴 분자의 K6, K11, K27, K29, K33, K48 및 K63이 기질 단백질에 결합되어 있습니다. 일반적으로 K48의 유비퀴틴화는 프로테아좀에 의해 인식될 수 있다고 믿어집니다. 따라서 기질단백질의 유비퀴틴 사슬이 K48 사슬인지 확인하는 것이 필요하다. 유비퀴틴 분자 내 단일 라이신 지점을 돌연변이시키거나(도 21 참조) 유비퀴틴 분자 내 단일 라이신을 돌연변이시키고(도 23 참조), 면역침전 및 면역블로팅 방법을 통해 기질 단백질의 유비퀴틴화 유형을 검출합니다(도 22 및 도 2 참조). 24.

기질 단백질의 유비퀴틴화 수준의 변화는 E3 유비퀴틴 리가제를 과발현(그림 25)하거나 녹다운(그림 26)하여 감지했습니다.

시험관 내 유비퀴틴화는 신체의 복잡한 환경을 제거하여 E3 유비퀴틴 리가제가 기질 단백질과 직접 상호작용할 수 있도록 하여 기질 단백질의 E3 유비퀴틴 리가제 유비퀴틴화를 더욱 설득력 있게 만듭니다. 시험관 내 UB, E1, E2, ATP 및 완충액에 대한 상용 키트를 사용할 수 있습니다. 기질 단백질의 유비퀴틴화를 검출하기 위해 시험관 내 유비퀴틴 반응을 위해 E3 유비퀴틴 리가제 및 기질 단백질을 정제하기만 하면 됩니다.