①킬달 질소 정량법
원리: 단백질의 평균 질소 함량은 16입니다. 시료를 진한 황산으로 가열하면 단백질 질소가 암모늄염으로 전환되며, 암모니아는 강알칼리성 조건에서 증발되고 지시약을 사용하여 붕산을 흡수합니다. 표준산은 단백질에 함유된 질소 함량과 단백질 함량을 알 수 있습니다.
② 뷰렛 방법
원리: 요소는 180°C에서 탈아미노화되어 뷰렛을 형성하며, 이는 알칼리 용액에서 Cu2와 안정한 자홍색 착물을 형성할 수 있습니다. 단백질의 펩타이드 결합은 실제로 아미드 결합이므로 폴리펩타이드, 단백질 등은 모두 뷰렛 반응을 일으켜 파란색 또는 보라색 복합체를 생성합니다. 단백질 함량의 비색 측정.
단점: 민감도가 낮고, 시료가 용해성이어야 하며, 프롤린을 함유한 탄수화물과 펩타이드가 다량 존재하면 발색이 좋지 않습니다. 정확도가 낮고(수 mg) 시료 내 황산암모늄과 트리스의 영향을 받지만 정확도가 높고 단백질 유형에 영향을 받지 않습니다.
3폴린페놀법(로리)
폴린페놀법은 뷰렛법의 확장형으로 사용되는 시약은 A와 B로 구성된다. 시약 A는 뷰렛 시약(알칼리성 구리 시약)과 동일하며 시약 B에는 인몰리브덴산과 인텅스텐산이 포함되어 있습니다.
알칼리성 조건에서 단백질의 설프하이드릴 및 페놀 그룹은 Cu2를 Cu로 환원할 수 있습니다. Cu는 Folin-페놀 시약과 정량적으로 반응하여 파란색 물질을 생성할 수 있습니다. 단백질 함량은 600nm에서 비색적으로 측정할 수 있습니다.
감도는 높지만(약 0.1mg) 번거롭고 황산암모늄과 티올 화합물의 방해도 받습니다. 단계에서 다양한 시약을 혼합하는 데 특별한 주의를 기울이십시오. 그렇지 않으면 큰 오류가 발생합니다.
4UV법
280nm 광흡수법 : Tyr를 사용하여 280nm에서 흡수하여 측정합니다.
280nm-260nm 흡광차법: 시료 용액에 소량의 핵산이 있을 경우 다음 공식에 따라 계산합니다.
단백질 농도(mg/ml)= 1.24E280-0.74 E260 (280 260이 코너마크)
⑤색소결합법(브래드포드법)
직접결정법: 단백질과 색소분자의 조합을 이용(쿠마시 브릴리언트 블루) G-250) 광흡수는 분광광도법으로 측정되었습니다.
단백질 함량은 CBG(쿠마시 브릴리언트 블루) 염색으로 측정했습니다. CBG는 지표와 약간 유사하며 다양한 pH 수준에서 색상이 변합니다. 산성 조건에서는 차이고 중성 조건에서는 파란색입니다. CBG가 단백질에 연결되면 단백질이 CBG에 보다 중립적인 환경을 제공하기 때문에 파란색으로 변합니다. 샘플에 단백질이 많을수록 CBG가 단백질에 더 많이 끌리고 파란색이 향상됩니다. 따라서 파란색의 강도는 샘플의 단백질 양에 정비례합니다.
간접 측정 방법: 단백질은 특정 산성 또는 염기성 색소 분자와 결합하여 불용성 염 침전물을 형성합니다. 분광광도계를 사용하여 결합되지 않은 색소를 측정하고 단백질 함량을 샘플 1g당 결합된 색소의 양으로 표시합니다.
⑥BCA 방법
BCA(Bicinchoninc acid process, 4,4'-dicarboni-2,2'-diquinoline) 방법은 Lowry 방법과 유사하지만 가장 큰 차이점은 알칼리도 용액에서 단백질이 Cu2를 Cu로 전환한 후 BCA를 사용하여 Folin 시약을 대체하고 Cu와 결합하여 562 nm의 파장에서 강한 흡수를 보이는 진한 보라색을 생성합니다.
알칼리 용액의 BCA는 폴린 시약보다 안정성이 높기 때문에 BCA와 알칼리 구리 이온 용액을 결합하는 발색 반응은 한 단계만 완료하면 완료됩니다. 민감도는 Lowry의 방법과 유사합니다.
이 방법은 음이온성, 비이온성, 양성이온성 세제와 요소에 더 잘 견디며 방해할 가능성은 적지만 환원당과 EDTA에 의해 방해를 받습니다.
7콜로이드 금 측정 방법
콜로이드 금은 클로로금산의 하이드로졸이며 전자 밀도가 높고 생물학적 거대분자의 다양한 조합과 상호 작용할 수 있습니다.
콜로이드 골드는 음전하를 띤 소수성 콜로이드로, 단백질에 노출되면 파란색으로 변하는 색상 변화가 단백질과 정량적으로 관련되어 있어 단백질의 정량 측정에 활용될 수 있습니다.
8기타 방법
일부 단백질에는 특수한 비단백질 그룹이 포함되어 있습니다. 예를 들어 퍼옥시다아제에는 403nm 파장에서 흡광도를 측정하여 정량화할 수 있는 헴 그룹이 포함되어 있습니다. 카드뮴과 같은 특정 금속을 함유한 효소는 해당 금속을 추적할 수 있습니다.